جستجو در سایت :   

دانشگاه شهید باهنر کرمان

دانشکده دامپزشکی

 موضوع:

  انتشار فیلوژنتیکی جدایه های اشریشیاکلی واجد ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین در مدفوع بلدرچین های سالم 

اساتید راهنما:

دکتر رضا قنبرپور

دکتر محمود صالحی

استاد مشاور:

دکتر  محمد خلیلی

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی گردد

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود می باشد)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل می باشد)

اختصار فارسی

دسته ای از سویه های اشریشیاکلی که قابلیت بیماری زایی در بلدرچین را ندارند اما از جنبه بهداشت عمومی با اهمیت تلقی می شوند سویه های تولید کننده شیگاتوکسین می باشند. هدف از این مطالعه شناسایی گروه و تحت گروه های فیلوژنی و تعیین حضور ژن های شیگاتوکسین و اینتیمین در جدایه های اشریشیاکلی از مدفوع از بلدرچین های سالم بوده می باشد. در این مطلعه 235 نمونه مدفوع از بلدرچین سالم جمع آوری شده و متعاقبا جداسازی و تعیین هویت بیوشیمیایی سویه های اشریشیاکلی انجام گردید. از تمامی نمونه های اخذ شده از باکتری اشریشیاکلی جدا گردید و اسیدنوکلئیک از جدایه ها استخراج گردید. جدایه های طی دو روش مولتی پلکس PCR مورد مطالعه قرار گرفتند. بر اساس نتایج آزمایش PCR معلوم گردید که 235 جدایه مورد آزمایش در 4 گروه فیلوژنی انتشار دارند که بیشترین فراوانی مربوط به گروه A (55/62 درصد) و کمترین فراوانی مربوط به گروه B2 (90/8 درصد) بوده می باشد. از طرف دیگر 9 جدایه (83/3 درصد) نسبت به یکی از ژن های stx1، stx2 و eae مثبت بوده اند. بیشترین فراوانی مربوط به ژن eae ( 13/2 درصد) بود همچنین 3 جدایه (28/1 درصد ) دارای ژن stx2 و یک جدایه (43/0 درصد ) نیز واجد ژن stx1 بود. نه جدایه ی (83/3 درصد) مثبت از نظر ژن های قابل مطالعه در چهار گروه فیلوژنی A ، B1، B2 و D انتشار داشتند. تنها جدایه ی مثبت از نظر ژن stx1 در گروه فیلوژنی D قرار داشت سه جدایه ی مثبت از نظر ژن stx2 در دو گروه فیلوژنیD, A انشتار داشت. پنج جدایه ی مثبت از نظر ژن eae در چهار گروه فیلوژنی A ، B1، Dو B2 قرار اشتند از نظر آنتی بیوگرام بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به اکسی تتراسایکلین بود که 234 جدایه (57/99 درصد ) نسبت به این آنتی بیوتیک مقام بوده. بعد از  تتراسایکلین بیشترین اندازه مقاومت مربوط به آمپی سیلین بود که 160 جدایه (09/68 درصد) نسبت به این آنتی بیوتیک مقاوم بودند.  کلمات کلیدی: اشریشیاکلی، بلدرچین ، شیگاتوکسین، فیلوژنی

 فهرست مطالب

اختصار فارسی………………………………………………………………………………………………….

فصل اول:  مقدمه و هدف

مقدمه و هدف ……………………………………………………………………………………………….0

فصل دوم: کلیات و مروری بر منابع موجود

1-2- کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ((STEC اشریشیاکلی………………….5

1-1-2- وروتوکسین ها یا توکسین های شبیه شیگا  …………………………………………………………..5

2-1-2-  ژنتیک وروتوکسین    ………………………………………………………………………………………7

3-1-2- ساختمان وروتوکسین ها  ………………………………………………………………………………….8

4-1-2- ناهمگونی سویه های تولید کننده شیگاتوکسین   ………………………………………………….10

5-1-2- نامگذاری سویه های تولید کننده شیگاتوکسین  …………………………………………………..11

6-1-2-  اپیدمیولوژی پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین…………………………………………………..12

7-1-2- منابع انتشار سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ………………………………………………….

15 2-2- کلیاتی در مورد بلدرچین  ………………………………………………………………………..16

1-2-2- تاریخچه  ……………………………………………………………………………………………………..17

2-2-2-  شروع پرورش در جهان   ……………………………………………………………………………….17

3-2-2- شروع پرورش در ایران  ………………………………………………………………………………….18

4-2-2- جانور شناسی  ……………………………………………………………………………………………….19

5-2-2- نژادهای بلدرچین  ………………………………………………………………………………………….19

6-2-2- ویژگیهای عمومی بلدرچین  …………………………………………………………………………….21

7-2-2- جنبه های اقتصادی………………………………………………………………………………………….24

8-2-2- نکاتی در مورد شروع صنعتی پرورش  ……………………………………………………………….25

9-2-2- وسایل مورد نیاز برای نگهداری جوجه های بلدرچین   …………………………………………28

10-2-2- تغذیه بلدرچین  …………………………………………………………………………………………..30

11-2-2-  فراوری و بسته بندی گوشت و تخم بلدرچین ها   ……………………………………………..32

3-2- کلیاتی در مورد بیماری های بلدرچین   ………………………………………………………………….34

1-3-2- کلی باسیلوز در بلدرچین و طیور  ……………………………………………………………………..35

2-3-2- اشکال دیگر کلی باسیلوز در طیور  …………………………………………………………………..41

3-3-2- بیماری نیوکاسل  …………………………………………………………………………………………..42

4-3-2 -آنفلوانزا ……………………………………………………………………………………………………….45

5-3-2- برونشیت بلدرچین ………………………………………………………………………………………….46

6-3-2- بیماری آسپرژیلوز ………………………………………………………………………………………….50

فصل سوم: مواد  و روش کار

1-3- مواد و وسایل مورد بهره گیری  …………………………………………………………………………………54

2-3- روش‌کار  ………………………………………………………………………………………………………..55

1-2-3- جمع آوری و تقسیم بندی نمونه‌ها  ……………………………………………………………………55

2-2-3- کشت نمونه‌ها و جدا سازی اشریشیاکلی  ……………………………………………………………55

3-2-3- تأیید نمونه‌های اشریشیاکلی   …………………………………………………………………………..56

4-2-3- ذخیره نمونه‌ها  ………………………………………………………………………………………………56

5-2-3- آزمایش PCR  …………………………………………………………………………………………….57

1-5-2-3- استخراج DNA  ………………………………………………………………………………………57

2-5-2-3- آزمایش PCR جهت شناسایی ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین   ……………57

3-5-2-3-  آزمایش PCR جهت تعیین گروه و تحت گروه فیلوژنی  …………………………………59

4-5-2-3-  شناسایی و واکاوی محصولات PCR  ……………………………………………………………..61

1-4-5-2-3- مراحل انجام الکتروفورز  …………………………………………………………………………61

3-3- تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیکی  ………………………………………………………………………………64

فصل چهارم: نتایج

1-4- تعیین درصد جدایه های اشریشیاکلی در گروه های فیلوژنی   …………………………………….67

2-4- انتشار جدایه ها از مدفوع بلدرچین در تحت گروههای فیلوژنی  …………………………………68

3-4- نتیجه آزمایش PCR جهت شناسایی ژن های eae ، stx1 وstx2  ……………………………70

4-4- انتشار فیلوژنی جدایه های اشریشیاکلی مثبت از نظر stx1 ،eae و stx2   ……………………71

5-4- تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه ها  …………………………………………………………………73

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………….. 76

پیشنهادات  …………………………………………………………………………………………………………………..

منابع …………………………………………………………………………………………………………………….83

اختصار انگلیسی  …………………………………………………………………………………………………..90

باکتری اشریشیاکلی بطور معمول در دستگاه گوارش پستانداران و پرندگان هست.سویه های بیماریزا، در شرایط استرس محیطی و تضعیف سیستم ایمنی باعث ایجاد کلی‌باسیلوز[1] در طیور می شوند. سویه های بیماریزا همچنین باعث ایجاد بیماریهای گوارشی و عفونت دستگاه ادراری در بشر می شوند. سویه‌های بیماریزای اشریشیاکلی طیور[2]‌‌‌‌ (APEC) بصورت عادی جزء میکروفلور طبیعی دستگاه گوارش طیور می‌باشند و ممکن می باشد در سطوح مخاطی حیوانات اهلی و وحشی نیز پیدا نمود شوند. حدود 10 تا 15 درصد از کلی‌فرم[3]‌‌های روده، مربوط به سروتیپ‌های بیماریزا[4] می‌باشد. می‌توان سروتیپ‌های بیماریزا را همراه با سروتیپ‌های غیر بیماریزا[5] از محیط اطراف طیور جدا نمود. عفونت با سویه‌های APEC غالباً با عفونت‌های خارج گوارشی به ویژه عفونت‌های تنفسی و یا سیستمیک همراه می باشد.

در بلدرچین سویه های اشریشیاکلی  بیماریزا غالبا متعلق به گروههای سرمی O15,O4,O9,O38,O42,O88 و بعضی سروگروههای دیگر می باشند. سروگروههای مذکور از موردها سپتی سمی کلی باسیلی، سلولیت و موردها مرگ جنینی جدا شده اند (10). بلدرچین به عنوان یک میزبان برای کلی باسیلوز شناخته می گردد و پرورش دهندگان آن از این بابت خسارات زیادی را متحمل می شوند.

در کشور ما بعد از انقلاب، برای اولین بار پرورش بلدرچین[6] در استان یزد آغاز گردید که به صورت مجتمع شامل واحدهای مادر، گوشتی، بسته بندی و جوجه کشی اداره می گردد. وجود ویژگی‌های مناسب همچون رشد سریع، بلوغ زودرس، تولید تخم بالا، کوتاهی فاصله میان نسل‌ها، بالابودن تراکم پرورشی در واحد سطح، حساسیت کم نسبت به بعضی از بیماری‌های طیور، قیمت بالای تولیدات که شامل گوشت و تخم می‌باشد و به خصوص بازگشت سریع سرمایه سبب شده می باشد تا بلدرچین به عنوان یک پرنده مطلوب نزد کشاورزان و پرورش دهندگان تلقی شده و علاقمندان زیادی به پرورش صنعتی این پرنده روی آورند. بلدرچین دارای گوشتی با پروتئین بالا و درصد چربی کم می‌باشد که برای کودکان و بیماران بسیار سودمند و مفید می‌باشد.

پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین  (STEC) اشریشیاکلی عامل  بروز کولیت هموراژیک با منشا مواد غذائی در بشر می باشد. امروزه سویه های STEC به عنوان گروهی از عوامل مسبب بیماریهای مشترک بشر و دام شناخته شده و خصوصا در کشورهای در حال توسعه بیماری های قابل توجهی در بشر ایجاد می کنند  که شامل کولیت های هموراژیک و سندرم اورمی
می باشند. اخیرا مشخص شده که این سویه ها ممکن می باشد در دامها و طیور سالم هم حضور داشته باشند. مهمترین عامل بیماریزایی این سویه ها، تولید شیگاتوکسین می باشد که از مدفوع طیور و حیوانات سالم به محیط ،آب و غذا منتقل شده و باعث بیماری در بشر می گردد. سویه های STEC قادرند دو نوع شیگاتوکسین Stx1   و Stx2  را تولید نمایند. مطالعات  اندکی در زمینه سویه های STEC جدا شده از طیور ، انجام شده می باشد. از طرف دیگر  واکاوی فیلوژنتیکی باکتری اشریشیاکلی نشان داده می باشد که سویه های مختلف این باکتری در 4 گروه فیلوژنتیکی شامل A ,B1 B2 , وD  قرار دارند.

 از آنجائیکه تاکنون مطالعه فیلوژنتیکی بر روی سویه های اشریشیاکلی STEC جدا شده از بلدرچین وجود ندارد، پس هدف از انجام این پایان نامه جدا سازی اشریشیاکلی از مدفوع
بلدرچین های سالم و شناسائی سویه های واجد  ژن های کد کننده شیگا توکسین و انتیمین
 (Stx1 و  (eae, Stx2 و  تعیین گروه فیلوژنتیکی اشریشیاکلی به روش PCR می باشد.

1-2 کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین [7]((STEC اشریشیاکلی

کشف پاتوتیپ اشریشیاکلی های تولید کننده  شیگا توکسین (STEC) از زمانی آغاز گردید که گروهی از دانشمندان گزارش کردند که مایع فیلتر شده ی کشت تعدادی از سویه های مختلف اشریشیاکلی برای سلولهای ورو[8]  سایتوتوکسیک کشنده بوده و این فعالیت کشندگی سلول با آنتی سرم انتروتوکسین  [9] اشریشیاکلی های شبه کلرای کلاسیک خنثی نمی گردید. متعاقباً واکاوی 136 سویه  اشریشیاکلی عیان ساخت که 10 مورد از این سویه ها قادر به تولید این سیتوتوکسین سلول های ورو [10]هستند. بعد از اخذ این نتایج، اهمیت حضور سویه های اشریشیاکلی O26  تولید کننده سیتوتوکسین درارتباط با اسهال خونی مشخص گردید در سال 1983 ارتباطی بین یک سروتیپ نادر از اشریشیاکلی (O157:H7) والتهاب کولون خونریزی دهنده [11]  گزارش گردید. در همان سال گروهی از محققین ارتباط بین حضور شیگاتوکسین تولید شده توسط اشریشیاکلی و بروز سندرم یورمی بشر را مطرح کردند. این مشاهدات باعث توجه قابل ملاحظه ای به پاتوتیپ STEC گردید و از آن وقت  تاکنون بیش از 200 تیپ مختلف اشریشیاکلی گزارش شده اند که شیگاتوکسین تولید می کنند و تعداد زیادی از آنها با بیماری های بشر ارتباط دارند(4)

1-1-2 وروتوکسین ها یا توکسین های شبیه شیگا

از نظر تاریخچه در سال 1977 کنوالجوک[12] ، کلمه وروتوکسین را برای سیتوتوکسین اشریشیاکلی بکار برد در یک مطالعه که برروی 136 سویه اشریشیاکلی انجام گرفت، 7 مورد از 10 سویه ای که وروتوکسین تولید می کردند با بیماری اسهال انسانی و یک مورد از آنها با اسهال خوکها ارتباط داشتند. در یک مطالعه مقدماتی در سال 1977 و مورد کامل آن در سال 1982، گزارش گردید که سویه های خاصی از ETEC، سیتوتوکسینی را تولید می کنند که برای سلولهای هلا[13] کشنده می باشد همانند توکسین شیگا این سیتوتوکسین نیز از سنتز پروتئینی در سلول های هلا ممانعت می کند و از طرف دیگر در روده خرگوش اثرات آنتروتوکسیک داشته و برای موش نیز کشنده می باشد، به همین دلیل این سیتوتوکسین را توکسین شبیه شیگا نام نهادند. در سال 1983 SLT خالص گردید و نشان دادند که توکسین شیگا تولید شده بوسیله شیگلادیسانتریه و SLT تولید شده بوسیله اشریشیاکلی ازنظر خصوصیات فیزیکوشیمیایی و فعالیت های بیولوژی مشابهند (22).

در سال 1977 طی مطالعه ای مشخص گردید که وروتوکسین تولید شده بوسیله یک سویه خوکی و یک سویه انسانی، بوسیله آنتی سرم خاص وروتوکسین سویه دیگر خنثی نمی گردد و بدنبال آن، دو گروه آنتی ژنی وروتوکسین کشف گردید و آنها را VT2 , VT1 یا SLT-I و SLT-II نامیدند و متعاقب آن انواع SLT که با SLT-II مرتبط بودند شناسایی گردید مطالعات بعدی نشان داد که SLTها متعلق به دو گروه هستند که  گروه اول از نظر پادگنی فقط یک نوع داشته و تحت عنوان VT-1 یا SLT-1 نامیده می گردد و فعالیت آن بوسیله آنتی سرم توکسین شیگا خنثی می گردد و گروه دوم SLT، شامل سایر وروتوکسین هاست که شامل گروهی می باشد که از نظر آنتی ژنی، با هم ارتباط نزدیکی دارند و فعالیت سیتوتوکسیک این گروه بوسیله آنتی سرم ضد SLT-I و آنتی بادیهای ضدتوکسین شیگا خنثی نمی گردد. در اعضاء‌گروه دوم واریانتی از SLT-II که آن را  با SLT-II یا VTe نشان می دهند هست که در بیماری ادمی خوک دخالت دارد. SLT-II به این دلیل واریانتی  از SLT-II نامیده می گردد که، برخلاف ‌SLT-II برروی سلول های هلا اثر نداشته یا تاثیر کمتری دارد (37). البته SLT-IIa نیز واریانت دیگری می باشد که از موردها اسهال نوزادان جدا شده می باشد این توکسین بوسیله اشریشیاکلی O128 تولید می گردد (34 و 22).

 2-1-2 ژنتیک وروتوکسین

در آغاز مشخص گردید که ژنهای وروتوکسین ها مربوط به باکتریوفاژهای معتدل[14] بوده و متعاقب آن ژنهای SLT-I این باکتریوفاژها کلون گردید و توالی نوکلئوتیدهای آن تعیین گردید اپرن SLT-I، دوچارچوب خواندن[15] را شامل می گردد که یکی برای کد کردن تحت واحد A و دیگری برای تحت واحد کوچک B بکار می رود.

مقایسه توالی نوکلئوتیدی SLT-II نیز در اشریشیاکلی با SLT-I نشان می دهد که در مشابهت توالی نوکلئوتیدها ژنهای ساختمانی برای دوتوکسین در تحت واحد A 57% و در تحت واحد B، 60% می باشد (34).

همچنان که قبلا گفته گردید در گروه دوم SLT چندین نوع SLT-II هست و ژنهای هر کدام از آنها نیز مطالعه شده و با سایر SLTها مقایسه گردیده می باشد اما برای جلوگیری از طولانی شدن مبحث از تبیین آنها خودداری می گردد.

3-1-2 ساختمان وروتوکسین ها

ساختمان تحت واحدهای SLT بخاطر مشابهت آن با توکسین شیگا براحتی مطالعه شده و ساختار آن کاملا مشخص شده می باشد که به کمک اطلاعات بدست آمده از توالی نوکلئوتیدها و همچنین خالص سازی توکسین این امر میسر گردیده می باشد. SLTها از دو تحت واحد تشکیل شده اند که تحت واحد A  تقریبا 33 کیلودالتون و تحت واحدB حدود 5/7 کیلودالتون وزن دارد. تعداد تحت واحد B مشابه توکسین شیگا 5 تا بوده و در اتصالSLT به رسپتور گلیکولیپیدی تأثیر دارد.

از نظر فعالیت بیولوژی، تمامی وروتوکسین ها برای سلول های ورو (Vero) سمی بوده و برای موش کشنده اند همچنین برای خرگوش آنتروتوکسیک اند این توکسین مانع از سنتز پروتئین شده و کمتر از یک ساعت بعد از در معرض قرار گرفتن سلول، قابل تشخیص می باشد.  وروتوکسین ها برای سلول های اندوتلیال عروقی نیز سمی بوده و علائمی که در بیماری بروز می کند مربوط به تاثیر توکسین برروی این بافت ها می باشد.

موشی که مورد تزریق این توکسین قرار گیرد قبل از مرگ، دچار فلجی اندام خلفی می گردد که این حالت احتمالا بعلت آسیب به سیستم اعصاب مرکزی می باشد که بعدا منجر به مرگ حیوان می گردد.  در خرگوش و خوک نیز کانون های گسترده هموراژی در عروق وادم مغزی دیده می گردد که در اثر SLT ایجاد شده و ضایعات مغزی منجر به مرگ حیوان می گردد (20).

از نظر مکانیسم اقدام،‌هر دو توکسین SLT-I و SLT-II در نتیجه فعالیت N-RNA گلیکوزیدازی مانع از سنتز پروتئین در سلول های اکاریوت می گردند. وروتوکسین ها باعث شکستن پیوند خاص N- گلیکوزیدی در RNA ریبوزمی s28 شده و در نتیجه آن یک باقیمانده آدنینی آزاد می گردد و در نهایت سنتز پروتئینی صورت نمی گیرد.

از نظر اثرات بیماریزایی، سویه های تولید کننده این توکسین که تحت عنوان VTEC [16] نامیده می شوند در بشر سه سندرم ایجاد می کنند که عبارتند از اسهال، کولیت هموراژیک و سندرم اورمی همولیتیک(HUS)[17] (28)

اورمی همولیتیک با علائمی نظیر ناتوانی حاد کلیوی[18] ، ترمبوسیتوپنی[19] و آنمی همولیتیک[20] و اسهال توام می باشد.

تعداد صفحه :105

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   دانلود پایان نامه ارشد : بررسی رژیم غنی از چربی و پرخوری ناشی از آن

قیمت : 14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می گردد.

پشتیبانی سایت :        ****       serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***

دسته‌ها: پزشکی