جستجو در سایت :   

عنوان:کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی گردد

دانشکده کشاورزی

 

 

پایان­نامه کارشناسی ارشد رشته‌ علوم باغبانی

 

 

کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها

 

 

 

 

اسفند ماه 1388

 

 

 

 

 

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

چکیده

 

 

کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها

 

به کوشش

محمد ایرانی پور

 

میخک یکی از محبوب ترین، اقتصادی ترین و مهم ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی و رقم های چند رنگ و منحصر به فرد می باشد. محدودیت های موجود در روش های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده می باشد که کاربرد فنون جدید یاخته ای – مولکولی برای بهبود ویژگی های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. این پژوهش به مقصود مطالعه ریزافزایی ارقام استاندارد ’ ‘Rendz-Vousو مینیاتور’Panamera‘ توسط اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی، تعیین غلظت بهینه ماده گزینشگر کانامیسین و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها انجام گردید. بدین مقصود آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به گونه کامل تصادفی با 3 تکرار اجرا گردید. در این پژوهش، از قطعه های برگ گیاهان رشد یافته در گلخانه با سن 6 تا 8 هفته و پینه برای تهیه ریزنمونه بهره گیری گردید. انتقال ژن gus به میخک توسط سویه LBA 4404 باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید pBI121 اظهار کننده ژن بتاگلوکورونیداز انجام گردید. نتایج اندام زایی مستقیم نشان داد که میانگین تعداد شاخساره های نابجا برای هر دو رقم با افزایش غلظت BA به 9/0 میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که با NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت 3/0 میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد. ارزیابی تأثیر شرایط تاریکی و روشنایی بر باززایی ارقام توسط رویان زایی بدنی در مدت زمان های 30 و 60 روز نشان داد که در شرایط تاریکی مقدار پینه به دست آمده برای هر دو رقم به گونه معنی داری بیش از شرایط روشنایی می باشد. نتایج تشکیل پینه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘ بیش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کانامیسین مقاوم می باشد. گویا آلودگی باکتریایی تشکیل پینه و شاخساره را به عقب می اندازد. بدون آلودگی باکتریایی تشکیل شاخساره در غلظت 50 میلی گرم در لیتر کانامیسین برای رقم ’Rendz-Vous‘ به گونه کامل متوقف گردید در حالی که برای رقم ’Panamera‘ این اتفاق در غلظت 100 میلی گرم در لیتر کانامیسین صورت گرفت. در بهینه سازی انتقال ژن با اگروباکتریوم تأثیر غلظت باکتری، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون شیمیایی- بافتی و تجزیه PCR پیوستن ژن بتاگلوکورونیداز در شاخساره های تراریخت باززایی شده را اثبات نمود. چگالی نوری 5/0، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری به مدت 20 دقیقه و هم کشتی به مدت 3 روز سبب افزایش درصد شاخساره های تراریخت گردید. در این پژوهش رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ نسبت به رقم مینیاتور ’Panamera‘ کارایی انتقال ژن بالاتری نشان داد. اختلاف بین دو رقم در اندازه باززایی و کارایی تراریزش به دلیل اندازه کوچکتر ریزنمونه های برگ در رقم مینیاتور ’Panamera‘ قابل توجیه می باشد. گیاهک های باززایی شده از اندام زایی مستقیم، رویان زایی بدنی و تراریزش با اگروباکتریوم در آمیخته پرلایت و ورمیکولیت در شرایط رطوبت نسبی %95 نگهداری و سپس به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش انتقال ژن به میخک در ایران می باشد.

 

 

 

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

فصل اول: مقدمه. 2

1-1- منشاء. 3

1-2- اصطلاح‌شناسی. 4

1-3- انواع میخک. 4

١-4- گیاه‌شناسی و ریخت‌شناسی میخک. 5

١-5- روش‌های افزایش میخک. 7

1-6- اهمیت و اهداف پژوهش. 7

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین. 10

2-1- ریزافزایی و کشت بافت میخک. 10

2-1-1- گزینش ریزنمونه و گندزدایی سطحی آن. 10

2-1-2- ریخت زایی و باززایی. 12

2-1-3- رویان زایی بدنی. 13

2-1-3-1- تنظیم کننده های رشد. 14

2-1-3-2- محیط پینه زایی. 16

2-1-3-3- محیط ریشه زایی. 17

2-1-3-4- سن مواد گیاهی و شرایط کاشت. 18

2-1-4- مسیرهای رویان زایی بدنی. 19

2-2- انتقال ژن توسط اگروباکتریوم. 19

2-2-1- اساس ایجاد گال و پلاسمید Ti 20

2-2-2- انتقال TDNA.. 20

2-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباکتریوم. 22

2-2-3-1- نژادگان (ژنوتیپ). 22

2-2-3-1-1- ریزنمونه های شروع کننده. 22

2-2-3-1-2- سویه باکتری. 24

2-2-3-1-3- چگالی نوری. 25

2-2-3-1-4- انگیزاننده های ژن های بیماری زا. 26

2-2-3-1-5- مدت زمان هم کشتی. 27

2-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین. 28

فصل سوم: مواد و روش‌ها. 30

3-1- کشت بافت. 30

3-١-1- مواد گیاهی. 30

3-١-2- قسمت‌های گیاهی مورد بهره گیری در کشت بافت. 30

3-١-٣- گندزدایی ریزنمونه‌ها و وسایل. 31

3-١-4- آماده‌سازی ریزنمونه‌ها برای استقرار. 32

3-١-5- محیط کشت. 32

3-2- انتقال توسط اگروباکتریوم. 34

3-2-1- مواد. 34

3-2-1-1- بافر STET. 34

3-2-1-2- بافر الکتروفورز. 34

3-2-1-3- بافر CTAB.. 35

3-2-1-4- بافر TE. 35

3-2-1- 5- بافر سنجش GUS. 35

3-2-1-6- بافر بارگذاری. 35

3-2-1-7- محلول ذخیره آنتی بیوتیک کانامیسین. 36

3-2-1-8- محلول ذخیره آنتی بیوتیک ریفامپیسین. 36

3-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم. 36

3-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون. 36

3-2-1-11- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید. 37

3-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین. 37

3-2-1-13- محیط کشت LB (LuriaBertani) 37

3-2-1-14- سویه A. tumefaciens. 37

3-3- روش ها. 38

3-3-1- تهیه ریزنمونه. 38

3-3-2- تهیه محیط های کشت بافت گیاهی. 38

3-3-3- آغازگرها. 40

3-4- روش ها. 40

3-4-1- آماده سازی باکتری برای انجام انتقال ژن به ریزنمونه ها  40

3-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب. 41

3-4-3- آماده سازی ریزنمونه ها و اگروباکتریوم برای انتقال ژن به میخک. 42

3-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها. 43

3-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه. 43

3-4-6- گزینش و باززایی گیاهان تراریخت. 44

3-4-7- استخراج DNA از بافت های گیاهی با بهره گیری از محلول CTAB   45

3-4-9- روش کار. 47

3-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR.. 49

3-4-11- تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز برای مطالعه نتایج آزمون PCR.. 51

3-4-12- آزمون شیمیایی- بافتی برای تعیین فعالیت تراریخت GUS در شاخسارههای تراریخت. 51

3-4-13- واکاوی داده ها. 52

فصل چهارم: نتایج و بحث. 54

4-1- کشت بافت. 54

4-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک. 54

4-1-1-1- مواد گیاهی. 54

4-1-1-2- گندزدایی. 54

4-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی. 55

4-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم. 56

4-2-1- آزمایش مقدماتی. 58

4-2-1-1- گزینش با کانامیسین. 58

4-2-2- تولید گیاهان تراریخت. 61

4-2-3- تأیید گیاهان تراریخت با سنجش فعالیت GUS. 63

4-3- واکاوی PCR.. 64

4-4- تأثیر غلظت باکتری. 67

4-5- تاثیر زمان مایه زنی. 71

4-6- تاثیر مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن. 69

4-7- برهمکنش سه عامل چگالی نوری باکتری، مدت زمان مایه زنی ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی. 73

پیشنهادها. 77

منابع. 78

 

 

 

 

فهرست جدول­ها

 

 

عنوان                                                                                                             صفحه

جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلول­های پایه محیط کشت MS.  34

جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد بهره گیری.. 40

جدول 3-3- مواد مورد نیاز برای استخراج DNA ژنومی 47

جدول 4-3- مواد لازم در واکنش PCR.. 51

جدول 5-3- دوره های دمایی واکنش های PCR.. 51

جدول 1-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ رقم استاندارد’Rendz-Vous‘ .  57

جدول 2-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریز نمونه های برگ رقم Panamera‘.. 57

جدول 3-4- اندام زایی از ریزنمونه های برگ دو رقم میخک روی محیط دارای کانامیسین با و بدون آلودگی توسط Agrobacterium tumefaciens LBA 4404.  60

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   دانلود پایان نامه ارشد : تأثیرسطوح مختلف ازت و روی بر عملکرد و اجزای عملکرد پنج رقم بزرک

جدول4-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در تیمار چگالی های نوری مختلف باکتری.. 70

جدول 5-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های مایه زنی ریز نمونه ها با باکتری.. 71

جدول6-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های هم کشتی مختلف ریز نمونه ها با باکتری  74

جدول 7-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Rendz-Vous  76

جدول 8-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم Panamera‛ 77

 

 

 

 

فهرست نگاره­ها

 

 

عنوان                                                                                                                 صفحه

نگاره1-3. جایگاه های برشی پلاسمید pBI121. 43

نگاره1-4- ایجاد شاخساره و پینه پس از گذشت 8 تا 10 هفته از مایه کوبی برای رقم
RendzVous 63

نگاره 2-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘RendzVous‘. 64

نگاره 3-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Panamera65

نگاره 4-4- نتایج آزمون PCR در رقم RendzVous‘. وجود گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن GUS برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 7 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 8 و 9 مربوط به گیاهان ناتراریخت…. 66

نگاره 5-4- نتایج آزمون PCR در رقم ‘Panamera‘. گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن gus برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 4 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 5 تا 7 مربوط به گیاهان ناتراریخت. 67

نگاره 6-4- سنجش ژن GUS در ریزنمونه های پینه (A,B,C) و اندام های گل (D) باززایی شده در رقم ‘RendzVous‘. 68

 

کوتاهه­ها

6- بنزیل آمینو پیورین (6-benzyl amino-9-(tetrahyd­ropyran-2– yl)-9H-purine) BAP
پیشبر ویروس موزائیک گل کلم (Cauliflower mosaic virus promotor) CaMV 35S
آب دوبار تقطیر (Double distilled water) DDW
توفوردی (2و4- دی­کلروفنوکسی استیک اسید) (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 2,4-D
اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Ethylene diamine tetra acetic acid) EDTA
بتاگلوکورونیداز (β-Glucuronidase) GUS
محیط کشت لوریا – برتانی (Luria-Bertani Medium) LB
محیط کشت موراشیگی و اسکوگ (Murashige and Skoog Medium – 1962) MS
نفتالن استیک اسید (Naphthalene acetic acid) NAA
ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (Neomycin phosphotransferase gene) nptІІ
پلی­وینیل­پیرولیدون (Polyvinylpyrolidone) PVP
بافر سوکروز تریس اتیلن دی آمین تترا استیک اسید تریتون (Sucrose tris EDTA tritone buffer) STET
بافر تریس بورات اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Tris burate EDTA buffer) TBE
بافر تریس اتیلن دی­آمین تترا استیک اسید (Tris EDTA buffer) TE
DNA منتقل شونده (Transferred DNA) T-DNA
تیدیازرون (Thidiazuron) TDZ
وزن / حجم (Weigh / Volume) W/V

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1- مقدمه

 

 

گل هدیه‌ای می باشد به بشر از جانب خالق هستی و موهبتی می باشد برای تعالی روان، اندیشه و خرد بشر. اگر نگاهی به تمدن چندین هزار ساله ایران داشته باشیم، تأثیر داریوش بزرگ در مجموعه تخت‌ جمشید که یک دسته گل در دست دارد نشان‌دهنده این می باشد که فرهنگ مصرف گل از سال‌های دور در بین ایرانی‌ها مرسوم بوده می باشد.

میخک[1] بیش از ٢٠٠٠ سال می باشد که به دست بشر کاشته می گردد. این گل یکی از مهم‌ترین محصولات گلکاری دنیا می‌باشد که هم به جهت زیبایی و گوناگونی رنگ و هم از نظر اقتصادی از اهمیت قابل توجهی برخوردار می باشد (لارسون، 1375؛ Burich, 1996). در ایران کشت و کار میخک از سال‌ها پیش متداول بوده می باشد و در حال حاضر برای تولید گل بریدنی در سطح وسیع کشت می گردد (خلیقی، 1380).

کوشش‌های وسیعی در سراسر جهان برای بهبود کمیت و کیفیت میخک در جریان می باشد. امروزه اهداف بهنژادی آن شامل: افزایش دامنه رنگ گل‌ها، معرفی شکل‌های جدید گل‌ها، افزایش تحمل به نور کم و دامنه وسیع‌تر دما، بهبود شاخه‌دهی در انواع مینیاتور، افزایش پراکندگی تولید، طولانی کردن عمر پس از برداشت، قوی کردن ساقه، مقاومت به حشرات و بیماری‌ها و افزایش عطر آن می‌باشد (Bunt and Cockshull, 1985).

 

 

 

1-1- منشاء

 

میخک با نام علمی Dianthus caryophyllus L. یکی از گیاهان بسیار قدیمی می باشد و پیشینه کشت و کار طولانی دارد (خلیقی، 1380). عقیده براین می باشد که میخک بومی نواحی مدیترانه می باشد (لارسون، 1375). میخک‌ها بومی نواحی سرد کوهستانی از جنوب اروپا تا هند می‌باشند. گونه‌های بومی آن تنها در فصل بهار به علت افزایش دما و طول روز گل می‌دهند (لارسون، 1375، Tutin et al, 1993). ارقام جدید میخک ویژگی پیوسته گلدهی[2] داشته و در شمال‌غربی اروپا و آمریکای شمالی و در مناطق مدیترانه‌ای در گلخانه‌های پلاستیکی بدون سیستم گرمایش برای تولید گل بریدنی پرورش داده می شوند (Bunt and Cockshull, 1985) هم‌چنین در مناطق استوایی در صورت مناسب بودن عرض جغرافیایی که موجب کاهش دمای هوا می گردد (مانند کلمبیا و کنیا) می‌تواند کشت گردد (Bunt and Cockshull, 1985). بشر از قرن شانزدهم روی میخک بومی کار بهنژادی انجام داده می باشد. بهنژادی برای پیوسته گلدهی نژاد میخک در سال ١٨۴٠ در فرانسه انجام و در سال ١٨۵٢ در آمریکا معمول گردید. معروف‌ترین ارقام خارجی میخک از رقم ’William Sim‘ که در سال ١٩٣٨ یا ١٩٣٩ توسط ویلیام سیم تولید گردید، بدست آمده‌اند (خلیقی، 1380). میخک‌های امروزی شباهت بسیار کمی به اسلاف خود دارند. این میخک‌ها در تمام طول سال گل می‌دهند و دارای ساقه‌های بلند و محکم با گل‌های درشت و پُر پر و رنگ‌های گوناگون می‌باشند (لارسون، 1375).

 

 

1-2- اصطلاح‌شناسی[3]

 

در حدود ٣٠٠ سال پیش از میلاد مسیح تئوفراستوس[4] در باره میخک مطالبی نوشته می باشد که ترجمه آن از زبان یونانی گل خدایان[5] معنی می‌دهد که دلیل نامگذاری آن بوی خوش این گل می باشد. نام زیرگونه‌های گونه caryophyllus به احتمال منشعب از واژه Coronation (تاجگذاری) می‌باشد، شاید به آن جهت که در اساطیر یونان تاج گلی از این گیاه برای قهرمانان درست می‌شده می باشد (لارسون، 1375). نام انگلیسی میخک Carnation می باشد. این نام گرفته شده از واژه لاتین Carnis می باشد که تصریح به رنگ صورتی کم رنگ بعضی ارقام آن دارد (Brickell, 1997). در یونان Dianthus به معانی گل خوشبخت[6] و گل خدایان می‌باشد. هم‌چنین عقیده براین می باشد که نام Dianthus از واژه‌های یونانی Dios به معنای خدا و Anthus به معنای گل گرفته شده می باشد )لارسون، 1375؛ Bunt and Marjorie, 1982).

  1. Carnation

[2]. Perpetual-flowering

[3]. Etymology

[4] Theophrastus

[5]. Flower of Zeus

[6]. Flower of Ĵove

***ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل و با فرمت ورد موجود می باشد***

متن کامل را می توانید دانلود نمائید

زیرا فقط تکه هایی از متن پایان نامه در این صفحه درج شده (به گونه نمونه)

اما در فایل دانلودی متن کامل پایان نامه

 با فرمت ورد word که قابل ویرایش و کپی کردن می باشند

موجود می باشد

تعداد صفحه :127

قیمت : 14700 تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ****       serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***