جستجو در سایت :   

گرایش:بیماری های گیاهی

عنوان:تغییرات اظهار ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی گردد

دانشکده کشاورزی

 

پایان­نامه­ی کارشناسی­ارشد در رشته مهندسی کشاورزی- بیماری­شناسی گیاهی

 

 

تغییرات اظهار ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

 

 

تابستان 1393

 

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

چکیده

تغییرات اظهار ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

به کوشش

سید حسین میرزابابایی

باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) بیمارگر مخربی می باشد که دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی می­باشد به­طوریکه به بیش از 180 گونه گیاهی حمله می­کند. مهمترین میزبان­های این بیمارگر درختان میوه هسته­دار، درختان میوه دانه­دار و گیاهان علفی می­باشد. به علت هم-تکاملی با بیمارگرها، گیاهان چندین مکانیسم دفاعی را برای حفاظت از خودشان ایجاد نموده اند. تجمع پروتئین های مرتبط با بیماریزایی مانند PR1, LOX2, PDF1.2و VSP2 یکی از مکانیسم های مقاومت گیاه به بیمارگر می باشد. ایجاد گیاهان مقاوم، یکی از مهمترین استراتژی ها در مدیریت بیماری در محصولات زراعی و درختان میوه مختلف می باشد. تشخیص مکانیسم های درگیر در پاسخ های گیاهان علیه بیمارگرها، می تواند تولید ارقام مقاوم را تسهیل کند و در این راستا، تشخیص ژن های درگیر در مقاومت گیاه میزبان می تواند گام سودمندی در توسعه ارقام مقاوم باشد. هدف از پژوهش حاضر مطالعه الگوی تغییر اظهار ژن PR1 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید و محدود کننده بیمارگرهای بیوتروف)، و ژن های LOX2, PDF1.2 و VSP2 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به جاسمونیک اسید محدود کننده بیمارگرهای نکروتروف و حشرات گیاهخوار)، در گیاه آرابیدوپسیس مایه زنی شده به Pss و در دو فاز مختلف رویشی و زایشی بود. نمونه های گیاه آرابیدوپسیس در زمان های 0، 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی جمع آوری گردید و اندازه جمعیت باکتری Pss در سطح گیاه نیز در این زمان­ها مورد مطالعه قرار گرفت. سپس RNA کل استخراج گردید و سنتز cDNA و تغییرات اظهار چهار ژن با بهره گیری از روش Real time RT-PCR سنجیده گردید. نتایج کلی نشان داد که گیاهان آرابیدوپسیس از مسیر دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید برای مقاومت به باکتری Pss بهره گیری نموده می باشد و این که در فاز زایشی نسبت به فاز رویشی این مقاومت بیشتر می باشد. همچنین همکنش بین دو مسیر دفاعی وابسته به SA و JA نیز به اثبات رسید.

کلمات کلیدی: مقاومت سیستمیک اکتسابی، مقاومت سیستمیک القایی، اظهار ژن، پروتئین های مرتبط با بیماریزایی

 


فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه

فصل اول 1

1-1- مقدمه 2

1-2- اهداف 3

فصل دوم: پیشینه پژوهش 5

2-1- خصوصیات کلی Pss 6

2-1-1- موقعیت تاکسونومیکی 6

2-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss 7

2-1-3- دامنه میزبانی 7

2-1-4- بیماریزایی P. syringae 8

2-2- آرابیدوپسیس 9

2-3- واکنش Real-time RT-PCR 10

2-3-1- اظهار ژن (Gen Expression) 11

2-4- دفاع در گیاهان 11

2-4-1- مقاومت ساختاری و القایی 12

2-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Systemic Aquired Resistance (SAR) 14

2-4-3- مقاومت سیستمیک القایی Induced Systemic Resistance (ISR) 17

2-4-4- پاسخ دفاعی 18

2-4-5- سیگنال های موجود در مقاومت به بیماری های گیاهی 18

2-4-6- تشخیص الیسیتورهای باکتریایی توسط سلول های گیاهی 21

2-4-7- همکنش گیاه- Pseudomonas syringae 24

2-4-8- تغییرات در سطح سلول 26

2-5- تأثیر دفاعی هورمون ها در گیاهان 27

2-5-1- هورمون سالیسیلیک اسید 29

2-5-2- هورمون جاسمونیک اسید 29

2-5-3- هورمون اتیلن 29

2-5-4- هورمون آبسیزیک اسید 30

2-5-5- هورمون اکسین 31

2-6- همکنش مسیر های هورمونی (Cross-talk) 32

2-6-1- اثر آنتاگونیستی SA بر سیگنالینگ JA 36

2-7- القاگرهای شیمیایی دفاعی در گیاهان 37

2-8- مطالعه تعدادی از ژن های مرتبط با دفاع در گیاهان 38

2-8-1- ژن PDF1.2 38

2-8-2- ژن VSP2 38

2-8-3- ژن LOX2 39

2-8-4- ژن PR1 40

2-9- ملاحظات 40

فصل سوم: مواد و روش ها 42

3-1- تهیه باکتری Pss 43

3-1-1- خالص سازی باکتری 43

3-1-2- آزمون تولید لوان 43

3-1-3- آزمون تولید رنگ فلورسنت 44

3-1-4- آزمون اکسیداز 44

3-1-5- آزمون واکنش فوق حساسیت (HR) 44

3-1-6- اثبات بیماری زایی روی گیاه گوجه فرنگی 44

3-1-7- آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) 45

3-2- کاشت گیاه آرابیدوپسیس 47

3-2-1- محیط کشت آرابیدوپسیس 47

3-2-2- شرایط گلخانه 48

3-2-3- مایه زنی با Pss 49

3-2-4- نمونه برداری 49

3-3- مطالعه اندازه جمعیت باکتری Pss 50

3-4- استخراج DNA 51

3-4-1- طرز تهیه بافر CTAB 52

3-4-2- تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل 52

3-5- استخراج RNA از بافت 52

3-5-1-تهیه آب تیمار شده با DEPC 53

3-5-2- تعیین کمیت و کیفیتRNA 54

3-5-3- تیمار DNase 54

3-5-4- توقف تیمار DNase 54

3-5-5- سنتز رشته اول cDNA با بهره گیری از RNA استخراج شده 55

3-5-6- تکثیر قطعه مورد نظر با بهره گیری از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز 56

3-5-7- اسامی و توالی آغازگرهای مورد بهره گیری برای مطالعه اظهار ژن ها 57

3-6- واکنش Real-time RT-PCR (Relative) 57

3-6-1- واکنش Real-time RT-PCRژن های مقاومت و ژن کنترل داخلی 58

3-6-2- روش نرمال سازی نسبی اظهار ژن ها 59

3-6-3-واکاوی آماری اظهار ژن ها 59

فصل چهارم: نتایج 60

4-1- آزمون های تشخیصی اولیه 61

4-1-1- بهره گیری از PCR جهت تشخیص Pss 62

4-2- مطالعه جمعیت باکتری پس از مایه زنی 62

4-3- استخراج Total RNA از بافت گیاه 64

4-3-1- تعیین کیفیت Total RNA 64

4-3-2- تعیین غلظت Total RNA با بهره گیری از نانودراپ 64

4-3-3- تیمار DNase 65

4-3-4- مطالعه صحت سنتز cDNA 66

4-5- مطالعه اظهار ژن ها 66

4-5-1- ژن PR1 67

4-5-2- ژن VSP2 68

4-5-3- ژن PDF1.2 70

4-5-4- ژن LOX2 71

4-5-5- الگوی اظهار ژن ها در دو فاز مختلف رویشی و زایشی گیاهان آرابیدوپسیس 73

فصل پنجم: بحث 75

5-1- بحث 76

5-2- مطالعه دفاع ذاتی وابسته به هورمون های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید 77

5-3- واکاوی مقایسه ای تغییرات اظهار ژن ها 79

3-۵-1- مطالعه پاسخ ژن PR1 علیه Pss 79

3-۵-2- مطالعه پاسخ ژن PDF1.2 علیه Pss 81

5-3-3- مطالعه پاسخ ژن LOX2 علیه Pss 82

3-۵-4- مطالعه پاسخ ژنVSP2 علیه Pss 83

5-4- تعیین جمعیت باکتری 84

5-5- نتیجه گیری نهایی 85

5-5-1- دو فرضیه احتمالی برای اظهار مسیر وابسته به JA بلافاصله بعد از مسیر وابسته به SA 86

پیشنهادات 90

منابع 91

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

عنوان                               صفحه

شکل 3-1- کاشت گیاهان آرابیدوپسیس در سیستم هیدروپونیک 49

شکل 4-1- انجام واکنش HR در گیاه توتون و شمعدانی وآزمایش بیماریزایی در گیاه گوجه فرنگی 61

شکل 4-2- الکتروفورز محصول PCRتشخیصی با بهره گیری از جفت آغازگرهای B2 و B1 62

شکل 4-3- مطالعه جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری پس از مایه زنی در دو فاز مختلف رویشی و زایشی 63

شکل 4-4- الکتروفورز Total RNA استخراج شده از بافت ها 64

شکل 4-5- طیف جذب نوری Total RNA استخراج شده با بهره گیری از نانودراپ 65

شکل 4-6- الکتروفورز محصول PCR بعد از تیمار DNase 65

شکل 4-7- الکتروفورز محصول PCR پس از سنتز cDNA 66

شکل 4-8-تغییرات اظهار ژن PR1 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 68

شکل 4-9- تغییرات اظهار ژن VSP2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 69

شکل 4-10-تغییرات اظهار ژن PDF1.2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 71

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   دانلود پایان نامه ارشد:نقش روشهای آموزشی- ترویجی در کاهش استفاده از سموم و نهاده ها در کشت سبزیجات در شهرستان ری

شکل 4-11-تغییرات اظهار ژن LOX2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی 72

شکل 4-12- الگوی تغییرات اظهار ژن ها در فاز رویشی گیاهان 74

شکل 4-13- الگوی تغییرات اظهار ژن ها در فاز زایشی گیاهان 74

فهرست جداول

عنوان                                           صفحه

جدول 3-1- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام واکنش 25 میکرولیتری PCR جهت تشخیص Pss 45

جدول 3-2- سیکل دمایی PCR با آغازگرهای B1-B2 برای تشخیص Pss 46

جدول3-3- نوع و مقدار عناصر غذایی محیط کشت هوگلند 48

جدول 3-4- مقادیر و نوع مواد مورد نیاز برای تهیه 100 میلی لیتر بافر CTAB 52

جدول 3-5- نوع و مقدار مواد مورد نیاز برای تیمار DNase 54

جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد بهره گیری در سنتز رشته اول cDNA در مرحله اول 55

جدول 3-7- نوع و مقدار مواد مورد بهره گیری در سنتز رشته اول cDNA در مرحله دوم 55

جدول 3-8- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام یک واکنش 20 میکرولیتری PCR 56

جدول 3- 9- سیکل دمایی PCR با آغازگر ef1-α 56

جدول 3-10- اسامی و توالی آغازگرهای مورد بهره گیری برای مطالعه اظهار ژن ها 57

جدول 3-11- سیکل دمایی مورد بهره گیری در واکنش Real-time RT-PCR 58

جدول3-12- نوع و مقدار مواد مورد بهره گیری در واکنش 20 میکرولیتری Real-time RT-PCR برای ژن های اصلی و کنترلی داخلی 58

جدول 4-1- مقایسه میانگین جمعیت باکتری Pss در دو فاز مختلف زایشی و رویشی 63

جدول 4-2- مقایسه میانگین اظهار ژن PR1 67

جدول 4-3- مقایسه میانگین اظهار ژن VSP2 68

جدول 4-4- مقایسه میانگین اظهار ژن PDF1.2 70

جدول 4-5- مقایسه میانگین اظهار ژن LOX2 71


فصل اول


1-1- مقدمه

یکی از مهمترین عوامل بیماریزا در گیاهان باکتری های وابسته به جنس Pseudomonas هستند. این گروه از باکتری ها جزو مهمترین بیمارگرهای گیاهی بوده که تأثیر عمده ای در پایین آوردن کمیت و کیفیت محصولات کشاورزی داشته و دارای گسترش جهانی نیز می باشند، و بیماری هایی از قبیل لکه برگی، بلایت، پژمردگی آوندی، پوسیدگی نرم، شانکر و گال در گیاهان مختلف ایجاد می کنند.

یکی از بیماری های مهمی که توسط باکتری های این گروه ایجاد می گردد شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار می باشد که توسط Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) ایجاد می گردد و یکی از معضلات کشاورزان در سراسر جهان به شمار می رود .(Vicente et al., 2004) این بیماری خسارت زیادی وارد می سازد و سبب خشک شدن نهال ها و درختان جوان، کاهش محصول در درختان مسن و گاهی خشکیدگی جوانه ها و گل های درختان بیمار می گردد و معمولاً در باغ های جوان موجب نابودی درختان به اندازه 10 تا 75 درصد می گردد (Agrios, 2005). باکتری عامل بیماری شانکر اولین بار از یاس جداسازی و در سال 1902 به این نام نامگذاری گردید (Hirano and Upper, 2000). در ایران اولین بار بیماری شانکر باکتریایی از درختان زردآلو در اصفهان گزارش و اندازه خسارت ناشی از آن 22 تا 50 درصد ذکر گردید (بهار و همکاران، 1361).

باکتری Pss علاوه بر بیماری شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار، عامل بیماری های مهمی همچون لکه قهوه ای لوبیا، بلاست مرکبات، لکه باکتریایی سورگوم و نوار قرمز نیشکر می باشد (Gross and Devay, 1977; Hirano, 1995; Rahimian, 1995). این باکتری بعنوان بیمارگر از گندم، ذرت، ارزن، سیب، گلابی، چغندر قند، کیوی و شمار دیگری از گیاهان زراعی و علف های هرز نیز جداسازی شده می باشد(Balestra and Varvaro, 1997; Garden et al., 1991; Lindow, 1982).

در ایران باکتری مذکور تاکنون از گیاهان مختلفی مانند نیشکر (Rahimian, 1995)، درختان میوه هسته دار (بهار و همکاران، 1361؛ مزارعی و قاسمی، 1372) و گندم (افیونیان و صحراگرد، 1375) جداسازی شده می باشد. این باکتری همچنین روی گیاه گوجه فرنگی نیز ایجاد بیماری می کند، اگرچه این بیماری به ندرت عملکرد را کاهش می دهد اما باعث کاهش کیفیت می گردد (Gleason and Edmunds, 2006).

جمعیت این باکتری با مراحل رشدی گیاه ارتباط دارد. به طوریکه در زمان متورم شدن جوانه ها و ظهور شکوفه ها که اندازه تراوه های گیاه زیاد می باشد، جمعیت این باکتری نیز بسیار بالاست. در این موقع اندازه ترشحات و مواد قندی گیاه فراوان می باشد و باکتری از آنها برای تغذیه خود بهره گیری نموده و جمعیت خود را افزایش می دهد.

گویا سویه هایPss در میزبان های مختلف، دارای نوعی ویژگی تخصص میزبانی نیز هستند. به گونه مثال سویه های Pss جدا شده از لوبیا باعث ایجاد واکنش بیماریزایی روی لوبیا می شوند در حالیکه سویه های این باکتری که از سایر میزبان ها جدا شده اند، تولید واکنش های غیر بیماریزایی در لوبیا می نمایند (Little et al., 1998).

نام این باکتری اغلب با سه اصطلاح اپی فیت، بیمارگر و هسته یخ همراه بوده می باشد که نشان دهنده اهمیت حضور Pss روی گیاهان میزبان می باشد (Hirano et al., 1995).

1-2- اهداف

به دلیل اهمیت این باکتری از نظر ویژگی های گستردگی دامنه میزبانی، اپی فیتی، ایجاد هسته یخ و بیماریزایی تحقیقات زیادی روی Pss صورت گرفته می باشد. به گونه مثال سیستم های بیماریزایی این باکتری مانند سیستم ترشحی پروتئینی نوع سه، زهرابه های دخیل در بیماریزایی آن مانند سیرینگومایسین و سیرینگوپپتین، ژن های مرتبط با بیماریزایی مانند syr B, syrD, hrp، افکتورهای پرآزاری و ناپرآزاری و … مورد مطالعه قرار گرفته اند. با وجود این تحقیقات گسترده و همچنین روش های مدیریتی گوناگون برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss، متاسفانه هنوز روش موثر و کارآمدی وجود ندارد. پس تحقیقات بیشتر جهت دستیابی به روش های موثر و جدید برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss مورد نیاز می باشد. یکی از این زمینه های تحقیقاتی درک مکانیسم مقاومت گیاه به بیمارگر می باشد. از این رو هدف غایی این پژوهش مطالعه همکنش بین آرابیدوپسیس- Pss و باز خوانی مسیرهای دفاعی گیاه آرابیدوپسیس به بیمارگر Pss می باشد. اهداف مد نظر این پژوهش در زیر آورده شده می باشد:

  • مطالعه تغییرات اظهار چهار ژن PR1, PDF1.2, LOX2 و VSP2 مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس آلوده به Pss
  • مطالعه همکنش دو مسیر دفاعی وابسته به سالسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss
  • مقایسه پاسخ های دفاعی گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss در دو فاز مختلف رویشی و زایشی
  • مطالعه اندازه جمعیت باکتریPss در دو فاز رویشی و زایشی گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی

 

***ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل و با فرمت ورد موجود می باشد***

متن کامل را می توانید دانلود نمائید

زیرا فقط تکه هایی از متن پایان نامه در این صفحه درج شده (به گونه نمونه)

اما در فایل دانلودی متن کامل پایان نامه

 با فرمت ورد word که قابل ویرایش و کپی کردن می باشند

موجود می باشد

تعداد صفحه :143

قیمت : 14700 تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ****       serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***